PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA

Le tecniche di fecondazione assistita

tecniche di fecondazione assistita

L’INSEMINAZIONE INTRAUTERINA (I.U.I.)

Si tratta di una tecnica di esecuzione semplice, ad invasività minima, con rischi per la salute della paziente pressochè nulli. Le indicazioni e le condizioni permittenti sono riportate nella tabelle 6 e 7. Consiste nel depositare il liquido seminale allíinterno della cavità uterina, consentendo cosÏ ad un elevato numero di spermatozoi di giungere in prossimità delle tube. Vengono quindi anche superati eventuali ostacoli al livello della cervice uterina. Di norma, dopo un rapporto, solo lo 0,1% degli spermatozoi riesce a superare subito il canale cervicale, ed una quantità ancora minore raggiunge poi le tube. Il liquido seminale deve essere preventivamente trattato secondo un procedimento detto di "capacitazione", che consente di concentrare e selezionare gli spermatozoi morfologicamente migliori e dotati di maggiore vitalità e di eliminare detriti, batteri ed elementi estranei. Dopo la preparazione il seme viene caricato in un apposito catetere ed introdotto, attraverso il canale cervicale, allíinterno della cavità uterina. La procedura è semplice ed indolore, e viene eseguita ambulatorialmente. L’inseminazione deve essere eseguita in un momento opportuno per la fecondazione, cioè durante il periodo dellíovulazione. Può essere quindi monitorato ecograficamente un ciclo spontaneo, in cui generalmente perviene a maturazione un solo ovocita, oppure eseguire una stimolazione dell’ovaio per ottenere una ovulazione multipla In questo caso, quando lo sviluppo follicolare, monitorato mediante ripetute ecografie endovaginali ed eventuali dosaggi plasmatici del 17-fl estradiolo, risulta soddisfacente, viene indotta la ovulazione mediante la somministrazione di HCG. L’I.U.I può essere eseguita una volta solamente, a 36 ore circa dalla somministrazione dell’HCG, oppure più volte, a cavallo del periodo ovulatorio. Ogni volta viene iniettata in utero una quantità di seme pari a circa 0,3 ml: nei 15-20 minuti successivi la paziente mantiene la posizione distesa prima di riprendere qualunque altra attività. La percentuale di gravidanze è del 15% circa per ciclo e del 20- 40% circa dopo 5-6 tentativi. Possiamo effettuare líinseminazione intrauterina anche con seme di donatore anonimo precongelato, in caso di azoospermia totale del partner od in caso di malattie genetiche potenzialmente trasmissibili al prodotto del concepimento ed alla partner. Per tale tecnica è anche utilizzabile seme del partner maschile congelato preventivamente, in previsione di interventi chirurgici o chemioterapici o radianti potenzialmente lesivi per la fertilità successiva.

tabella 6
Tabella 6

tabella 7
Tabella 7

FIVET

La nascita della prima bambina al mondo concepita "in vitro" (si trattava di una donna affetta da sterilità tubarica), si deve proprio, nel 1978, a tale metodica, che per lungo tempo ha rappresentato l'unica tecnica di concepimento assistito disponibile. La FIVET (fertilizzazione "in vitro" e trasferimento in utero di embrioni), poteva essere eseguita con seme omologo del partner o con seme di donatore, qualora il liquido seminale del partner non disponesse dei parametri minimi necessari per la fertilizzazione. La FIVET si articola sempre in tre tappe fondamentali, rappresentate dal prelievo degli ovociti (pickup), dalla loro fecondazione extracorporea e dal successivo trasferimento (transfer) degli embrioni sviluppatisi "in vitro" (cioè in laboratorio) all’interno dell’utero materno. Diverse varianti di questa metodica sono state messe a punto nel corso degli anni, sia in fase clinica che di laboratorio, varianti che hanno consentito di aumentare líefficacia delle T.R.A. e di ampliarne sempre di più le indicazioni. La prima gravidanza FIVET, nel 1978, fu ottenuta in un ciclo spontaneo, dopo avere cioè prelevato l’unico ovocita presente in un normale ciclo ovulatorio della donna e trasferendo poi un unico embrione. Fu in seguito chiaramente dimostrato, sin dall’inizio degli anni ottanta, che per incrementare l’efficacia della FIVET la donna doveva essere stimolata con farmaci induttori della ovulazione, che consentivano di portare a maturazione non solo il follicolo dominante ma anche tutti quelli della coorte altrimenti destinati all’atresia, così da prelevare più ovociti e trasferire nello stesso ciclo 3-4 embrioni all’interno dell’utero. Nel 1980, infatti, fu ottenuta la prima gravidanza in un ciclo "superstimolato", ed è da allora che l’induzione della crescita follicolare multipla è diventata una tappa fondamentale dei cicli di riproduzione medicalmente assistita.

LA CRIOCONSERVAZIONE DEGLI EMBRIONI E DEGLI OVOCITI

Talvolta come conseguenza di una "superovulazione" e della fertilizzazione "in vitro", gli embrioni ottenuti possono essere superiori al numero ritenuto ideale per un singolo transfer. Ecco che allora la possibilità di conservare gli embrioni in eccesso mediante un congelamento in azoto liquido (a temperature inferiori a 196°) permette di poterli trasferire in utero in un tempo successivo, evitando così di ripetere tutte le fasi di un nuovo ciclo. Dall’inizio degli anni ottanta sono state via via perfezionate le metodiche ed i tempi di congelamento, ed è oggi divenuto di estrema importanza, tecnica e morale, che i Centri di Medicina della Riproduzione possano eseguire la crioconservazione degli embrioni "in eccesso". Infatti, quando l’alternativa è unicamente la distruzione di patrimoni genetici umani, la crioconservazione diviene una insostituibile necessità etica. Le nuove tecniche di congelamento degli ovociti (che sono cellule e non organismi), attualmente in fase di studio, consentirebbero di porre fine ai dilemmi di ordine etico-morale legati alla crioconservazione degli embrioni.

LE TECNICHE ETEROLOGHE

La nostra esperienza, acquisita in quasi dieci anni prima della entrata in vigore della L.40, che ha espressamente vietato, in Italia, questa pratica, ci rende pronti e sicuri nelle procedure di fecondazione eterologa, cioè con spermatozoi od ovociti donati.
Le Banche di Gameti (spermatozoi ed ovociti) cui facciamo riferimento sono fra le migliori al mondo, accreditate dalla Comunità Europea, certificate, e rispettano tutte le normative europee sulla"donazione di gameti". Le donatrici/donatori hanno un'età compres fra 21 e 30 anni, sono stati sottopste/i a severi controlli genetici, ematologici, sierologici e psicologici. Disponiamo di materiale generico "pronto", con una vasta gamma di "fenotoipi" (caratteristiche somatiche), per cui non abbiamo TEMPI DI ATTESA, e nessuna difficoltà a selezionare il materiale genetico più "adatto".

OVODONAZIONE

Con tale tecnica si consente la possibilità di una gravidanza anche a tutte quelle donne che, pur possedendo un utero integro, non sono più in grado di produrre ovociti (il gamete femminile) per il concepimento. Si tratta di donne (circa il 10% delle donne sterili) che sono precocemente entrate in menopausa, donne le cui ovaie non sono più funzionanti a cause di terapie antiblastiche (es. terapie per neoplasie) o perchè le ovaie sono state asportate chirurgicamente, etc (tabella 8). La fecondazione in vitro di ovociti umani ha reso possibile la donazione di queste cellule da una donna all’altra. La nascita del primo bambino mediante ovodonazione risale al 1983 e da allora questa metodica si è largamente diffusa, nonostante le implicazioni etico-giuridiche che ne possono scaturire. L’utero della "ricevente" viene preparato allíimpianto di un eventuale embrione mediante la somministrazione di una ben precisa terapia ormonale sequenziale, che viene attuata, previa soppressione preliminare con analoghi del GnRH (vedi ), anche per le pazienti con una normale funzione ovarica. Questo protocollo viene attuato per migliorare la sincronizzazione tra donatrice e ricevente, ed ampliare il periodo in cui la ricevente può "aspettare" eventuali ovociti disponibili, in quanto l’embrione deve essere trasferito in un "periodo finestra" ben preciso del cosiddetto ciclo uterino.

tabella 8
Tabella 8

Gli ovociti della donatrice destinati alla donazione, una volta prelevati, sono inseminati "in vitro"con gli spermatozoi del marito della ricevente e posti in coltura (tabella 9). Gli embrioni che eventualmente si svilupperanno sono poi trasferiti in utero dopo 2-3 giorni dalla inseminazione. La ricevente non è la madre biologica del nascituro, ma essendo colei che lo partorisce, ne diviene la madre legittima. Nel nostro Centro le donatrici sono rappresentate esclusivamente da pazienti sterili, che si sottopongono a cicli di concepimento assistito, che donano volontariamente, in forma anonima e gratuita e che sottoscrivono un apposito consenso informato. Devono avere un’età inferiore a 36 anni, mappa cromosomica normale e assenza di malattie infettive ed ereditarie: deve essere comunque loro assicurato un numero di ovociti più che sufficiente per il proprio trattamento di riproduzione assistita. É anche per questa ragione che la disponibilità di ovociti è limitata ed imprevedibile, e spesso la ricevente "sincronizzata" non può disporre di cellule uovo donate in quel ciclo previsto. Della ricevente, che non deve essere di età superiore a quella riproduttiva naturale, viene studiata e valutata la presenza di eventuali controindicazioni alla terapia ormonale da eseguire, oltrechè la capacità di portare a termine una gravidanza senza eccessivi rischi per se e per il feto. Anche il marito deve sottoporsi ad esami che escludano malattie genetiche ed infettive trasmissibili alla prole.

tabella 9
Tabella 9

GIFT - ZIFT – TET

Si tratta di metodiche che consentono un approccio terapeutico pù fisiologico, poichè consistono nell’effettuare il transfer dei gameti o del prodotto del concepimento, allíinterno delle tube, laddove fisiologicamente avviene la fecondazione, e le prime fasi di crescita e segmentazione dell’embrione. Nella GIFT vengono trasferiti nelle tube i gameti maschili e femminile (ovociti e spermatozoi): la fecondazione avviene all’interno del corpo umano, cioè "in vivo". Se invece nelle tube sono trasferiti gli zigoti (ovociti appena fecondati) la tecnica si chiama ZIFT, oppure TET se vengono collocati nelle tube embrioni già in fase di divisione (2-4 cellule). È ovvio che il trasferimento intratubarico può essere eseguito solo qualora la funzionalità delle tube sia conservata, o solo lievemente alterata. Come per la FIVET, anche per la GIFT, ZIFT e la TET può essere utilizzato il seme del partner, o, se necessario, quello di un donatore. Queste metodiche trovano applicazione sempre più di rado, perchè il più delle volte è necessario sottoporre la donna ad una manovra chirurgica in anestesia generale, la laparoscopia o celioscopia, ottenendo poi percentuali di successo simili alla FIVET, tecnica sicuramente meno invasiva. Da qualche anno viene anche eseguito il trasferimento di gameti od embrioni nelle tube, attraverso la cervice uterina, mediante catetere, sotto guida ecografica od isteroscopica per semplificare la tecnica e renderla più accettabile, ma i risultati a tutt’oggi non sembrano incoraggianti.

TECNICHE DI MICROINIEZIONE DEGLI SPERMATOZOI

Queste tecniche, utilizzate sin dalla fine degli anni ottanta, hanno notevolmente migliorato i successi della PMA ed ampliato le indicazioni. Sin da allora, infatti, l’inseminazione "in vitro" veniva sempre eseguita mettendo a contatto l’ovocita con un certo numero di spermatozoi, mobili e morfologicamente normali, in una piccola quantità di terreno di coltura: tutte le successive tappe della fecondazione (superamento della barriera dell’ovocita, fusione della membrana plasmatica dell’ovocita, penetrazione all’interno del citoplasma) dovevano avvenire, se pur "in vitro", spontaneamente. Tutto ciò diveniva poco probabile od addirittura impossibile in caso di parametri seminali estremamente scarsi, cioè con un bassissimo numero di spermatozoi e/o con una motilità estremamente ridotta: l'eiaculato doveva garantire un numero sufficiente di spermatozoi mobili. Le tecniche di microiniezione (che sono metodiche di inseminazione meccanica degli ovociti), hanno consentito di superare queste limitazioni. La SUZI (microiniezione di spermatozoi sotto la zona pellucida dellíovocita), prima tecnica utilizzata nel 1990, e la PDZ (dissezione parziale della zona pellucida dellíovocita maturo) sono state completamente abbandonate nel 1993 a favore della ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), i cui risultati sono nettamente superiori e più facilmente riproducibili. Con la ICSI viene iniettato, mediante un sofisticato micromanipolatore, un unico spermatozoo direttamente allíinterno del citoplasma dellíovocita. La ICSI può essere utilizzata, se necessario, in un ciclo FIVET, o ZIFT o TET od in un ciclo di ovodonazione, ma non, ovviamente in un ciclo GIFT, dove la fecondazione spontanea deve avvenire allíinterno delle tube. Nella tabella 10 sono schematizzate le principali indicazioni alle varie metodiche.

tabella 10
Tabella 10

MESA - TESE/A – PESA

Si tratta di tecniche che prevedono un prelievo chirurgico di spermatozoi dalle vie seminali. Con la MESA ( Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration), si esegue un prelievo dallíepididimo con tecniche microchirurgiche (durata 30 - 60 minuti) in anestesia generale, mentre la PESA (Percutaneus Epididimal Sperm Aspiration) ne rappresenta una semplificazione, in quanto il prelievo si effettua con un ago attraverso la cute e non è necessaria líanestesia generale. La TESE/A (TEsticular Sperm Extraction e TEsticular Sperm Aspiration) è un prelievo direttamente dal testicolo di frammenti di tessuto mediante, rispettivamente, procedura chirurgica oppure agoaspirazione. L’indicazione a queste tecniche è l’azoospermia (cioè l’assenza totale di spermatozoi nell’eiaculato), ma con una valida produzione di tali cellule che non possono però raggiungere le vie seminali (e quindi essere presenti nellíeiaculato) per un’ostruzione delle stesse (azoospermia escretoria). Con la TESE/A si può ovviare anche ad un parziale arresto maturativo degli spermatozoi (azoospermia secretiva). Gli spermatozoi ottenuti con queste tecniche chirurgiche vengono poi utilizzati, per lo più mediante ICSI, per líinseminazione in vitro degli ovociti. È anche prevista la crioconservazione di eventuali spermatozoi soprannumerari, per consentire líesecuzione di altri cicli FIVET, risparmiando al paziente ulteriori prelievi chirurgici.

AH (Assisted Hatching)

L’ovocita, e l’embrione sino al momento del suo impianto, sono normalmente rivestiti da una membrana di protezione, che prende il nome di zona pellucida. L’AH è una procedura di laboratorio che consiste nel creare, per via chimica o fisica, una piccola apertura nella zona pellucida subito prima del transfer in utero, così da favorire la fuoriuscita della blastocisti, migliorandone il contatto con la mucosa dell’utero. Le possibili indicazioni proposte per tale metodica sono riassunte nella tabella 11. Ulteriori dati si attendono per la conferma di una reale efficacia di tale accorgimento.

tabella 11
Tabella 11

BIOPSIA DELL'EMBRIONE

Alcuni Centri nel mondo eseguono questa metodica, che consiste nell’asportare un blastomero (cellula embrionale) da un embrione di 6-8 cellule, senza danneggiarlo, per eseguire poi, in tempi molto brevi (5-6 ore) alcune indagini di citogenetica. Attualmente si possono studiare solo alcuni cromosomi, (13-14 - 16 - 18 - 21 - 22) oltre a quelli sessuali. In futuro saranno certamente possibili sempre più approfondite analisi, che potrebbero rappresentare, ad esempio, una eccellente alternativa alla diagnosi prenatale invasiva (villocentesi, amniocentesi).

LE FASI DI UN CICLO DI RIPRODUZIONE ASSISTITA

INDUZIONE DELLA MATURAZIONE FOLLICOLARE MULTIPLA. La prima fase di un trattamento di riproduzione assistita consiste sempre nella stimolazione ovarica, per far si di portare a maturazione contemporaneamente più follicoli, e potere quindi disporre di più ovociti e, possibilmente, di più embrioni da trasferire. Esistono in commercio diversi farmaci per ottenere una "superovulazione", utilizzabili in svariate dosi e modalità a seconda dei differenti protocolli adottati. (Vedi tabella 12)

tabella 12
Tabella 12

In linea generale possiamo dire che i protocolli di stimolazione si dividono in due categorie e cioè quelli che si basano sull’utilizzo di clomifene e/o gonadotropine in un ciclo mestruale spontaneo, e quelli che ne prevedono invece la somministrazione solo dopo avere "azzerato" la funzionalità ovarica spontanea mediante i GnRH agonisti. Queste sostanze, mediante un meccanismo di "desensibilizzazione", inibiscono la produzione, da parte della ipofisi, di LH e FSH endogeni. Si evitano così interferenze con ‘LH e l’FSH esogeni somministrati con i farmaci, in modo che i follicoli maturi non vadano incontro ad un precoce invecchiamento o ad una ovulazione spontanea prima del prelievo degli ovociti, e si ottiene inoltre la maturazione di un maggior numero di follicoli (figura 1).

figura 1
Fig. 1

Esistono però anche degli svantaggi (che non inficiano tuttavia la validità di questi protocolli) che consistono nella più lunga durata della stimolazione e nell’aumento del dosaggio di gonadotropine da utilizzare. Si valuterà caso per caso la scelta del migliore protocollo e dei dosaggi da adottare in funzione del tipo di trattamento di PMA, dell’età della donna, delle sue caratteristiche ovulatorie e di eventuali cicli precedenti effettuati. Si impone un monitoraggio stretto della risposta ovarica alla stimolazione, con frequenti ecografie vaginali e dosaggi dellíestradiolo plasmatico, per potere scegliere, di giorno in giorno, la migliore dose di farmaco per quella specifica donna. Può anche accadere che il ciclo di stimolazione venga sospeso, per evitare che una eccessiva risposta ovarica sfoci in una sindrome da iperstimolazione (vedi glossario), oppure perchè, viceversa, il numero di follicoli in maturazione non viene considerato adeguato. Il ciclo può essere eventualmente ripetuto in appresso adottando un differente protocollo di stimolazione. Qualora la risposta ovarica alla stimolazione sia invece considerata adeguata, i follicoli raggiungano un diametro preovulatorio (diametro medio superiore ai 18 mm) ed i livelli di estradiolo siano indicativi di una buona attività funzionale di questi follicoli (> 800 pg/ml), viene somministrato l’HCG, farmaco che completa la maturazione della cellula uovo, preparandola al meglio per la fecondazione.

PRELIEVO DEGLI OVOCITI (Pick-up).
Questa tecnica si esegue utilizzando aghi molto sottili, (16-18 G) che raggiungono i follicoli, passando attraverso la parete vaginale, sotto guida ecografica (ecografia con sonda transvaginale). (figura 2) Il prelievo degli ovociti si esegue circa 32-36 ore dopo la somministrazione di HCG, in sala operatoria ed affinchè risulti assolutamente indolore viene praticata una sedazione/analgesia per via endovenosa. Il liquido ottenuto dalla meticolosa e sistematica aspirazione di tutti i follicoli viene controllato in tempo reale, in laboratorio, sotto microscopio, per la individuazione degli ovociti. A questo punto la procedura può seguire vie diverse, a secondo della tecnica programmata, tenendo presente che, per convenzione, il giorno del pick-up viene definito "giorno zero".

figura 2
Fig. 2

INSEMINAZIONE, COLTURA, TRANSFER.
Nel caso sia stata prevista una GIFT, si sottopone la donna ad una laparoscopia in anestesia generale, subito dopo il pick-up ovocitario, per trasferire i gameti dentro le tube mediante una piccola cannula (figura 3).

figura 3
Fig. 3

Esiste la possibilità di effettuare il transfer mediante incannulamento trancervicale delle tube, evitando il tempo laparoscopico. È ovvio che il partner maschile ha già provveduto in precedenza a fornire il liquido seminale, che deve essere disponibile al momento del transfer intratubarico. Tutti gli altri programmi prevedono invece la coltura degli ovociti per 4-6 ore all'interno di appositi incubatori, e subito dopo la loro inseminazione con gli spermatozoi. Il liquido seminale può essere prodotto con una semplice eiaculazione, oppure prelevato con metodiche chirurgiche dalle vie seminali o dal testicolo (MESA - PESA - TESA/E). La presenza di almeno 40-50 mila spermatozoi "attivati" disponibili per ciascuno ovocita consente una inseminazione tradizionale per semplice contatto in terreno di coltura. In assenza dei parametri minimi, viene effettuata una inoculazione intracellulare di un solo spermatozoo mediante micromanipolazione (foto 1).

foto 1
Foto 1

L’ovocita inseminato viene posto in coltura per ulteriori 12-20 ore, dopo le quali viene controllata la presenza di due pronuclei che testimoniano l’avvenuta fecondazione, trasformando l’ovocita in uno zigote. Negli ormai rari casi in cui si ricorre alla ZIFT, nel giorno + 1 (il successivo cioè, al pick-up degli ovociti) la donna viene sottoposta a laparoscopia per trasferire 3-4 zigoti all’interno delle tube. Nelle altre metodiche la procedura prevede invece di prolungare la coltura degli zigoti rinnovando però il terreno, ancora per 20-24 ore, per consentire la divisione cellulare con la trasformazione degli zigoti in embrioni. Questi possono essere poi trasferiti dentro l’utero (FIVET) in un periodo compreso fra il giorno + 2 ed il giorno + 5, oppure al giorno + 2 dentro le tube (TET) durante una laparoscopia. Il transfer intrauterino è generalmente un tempo semplice, ma non banale, ed essendo indolore non richiede alcuna anestesia od analgesia. Un sottile catetere (diametro 1-1,5 mm), nel cui interno sono stati precaricati gli embrioni, viene introdotto in cavità uterina attraverso il canale cervicale: è richiesta una grande delicatezza per non danneggiare l’endometrio (la mucosa che riveste la cavità uterina) e gli embrioni, inficiando il successo del trattamento. Il numero ottimale di embrioni da trasferire dipende da diverse variabili, come l’età della donna, il grado e la qualità di sviluppo embrionario, l’esito di cicli di PMA precedenti, la possibilità di crioconservazione. Nella tabella 13 sono riassunte le varie tappe di un ciclo di concepimento assistito con le diverse varianti a seconda della metodica prescelta.

SUPPLEMENTAZIONE DELLA FASE LUTEALE.
Consiste in ripetute somministrazioni di progesterone, che vengono iniziate generalmente il giorno del transfer, per via intramuscolare o vaginale. Questa terapia trova motivazione nella insufficiente produzione di progesterone endogeno nella fase luteale dopo iperstimolazione ovarica, specie se sono stati utilizzati GnRH analoghi. Per gravidanza clinica si intende la presenza, rilevata mediante ecografia, di un sacco gestazionale in utero con embrione dotato di attività cardiaca. La percentuale di gravidanze cliniche per ciclo di PMA è, mediamente, del 20-25%, con un ampia variabilità correlata a diversi fattori. Fra questi l’età della donna (con una probabilità di successo nettamente ridotta dopo i 38 anni), la presenza di un fattore maschile (a parametri seminali alterati corrispondono tassi di fecondazione e di impianto via via peggiori), la tecnica utilizzata (il tasso di gravidanze, ad esempio, ottenuto dopo ovodonazione è generalmente superiore ai valori medi), ed anche in relazione con líesperienza del singolo Centro. È anche riportato un tasso di aborto e di gravidanze multiple superiore a quello della popolazione generale, mentre a tutt’oggi non è stato evidenziato alcun rischio di aumento di malformazioni nei bambini concepiti mediante tecniche di riproduzione assistita.






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